Disputado entre los días 1 y 16 de septiembre a partido único, aquí están los resultados de la segunda ronda de la Copa del Rey de futbol de la temporada 2009 – 2010.
| Local | Visitante | |
|---|---|---|
| Celta de Vigo | 2 – 1 | Real Unión |
| Ontinyent CF | 2 – 1 | UB Conquense |
| AD Alcorcón | 2 – 0 | CF Palencia |
| UE Sant Andreu | 3 – 1 | UD Melilla |
| CE Sabadell | 0 – 0 (1 – 3) | UD Marbella |
| CF Atlético Ciudad | 3 – 2 | Real Oviedo |
| CD Lagun Onak | 2 – 1 | AD Cerro de Reyes Atlético |
| CD Alcoyano | 2 – 0 | Villajoyosa CF |
| Polideportivo Ejido | 0 – 0 (8 – 7) | SD Ponferradina |
| UD Puertollano | 3 – 0 | Zamora CF |
| Cultural Leonesa | 4 – 0 | Unión Estepona |
| Albacete Balompié | 0 – 1 | Hércules CF |
| FC Cartagena | 3 – 2 (pr.) | Elche CF |
| Girona FC | 1 – 0 | Gimnàstic de Tarragona |
| Levante UD | 0 – 0 (3 – 4) | SD Huesca |
| Real Sociedad | 0 – 2 | Rayo Vallecano |
| UD Las Palmas | 2 – 1 | Cádiz CF |
| Real Betis | 1 – 2 | Córdoba CF |
| UD Salamanca | 1 – 1 (4 – 3) | CD Castellón |
| CD Numancia | 2 – 3 | Real Murcia |
| AD Ceuta | 2 – 2 (4 – 5) | Alicante CF |
| Mérida UD | 1 – 1 (5 – 4) | CF Reus Deportiu |