Disputado a partido de ida y vuelta los días 28 de octubre de 2009 (ida) y 10 de noviembre de 2009 (vuelta), en el mismo participaron todos los vencedores de la 3ª ronda, el Murcia y así como los equipos de la primera división de La Liga De Futbol Profesional. Pasaron a la siguiente ronda los equipos marcados en negrita.
| Ida | Vuelta | ||
|---|---|---|---|
| AD Alcorcón | 4 – 0 | 0 – 1 | Real Madrid |
| Cultural Leonesa | 0 – 2 | 0 – 5 | FC Barcelona |
| UD Marbella | 0 – 2 | 0 – 6 | Atlético de Madrid |
| Atlético Ciudad | 2 – 4 | 1 – 5 | Sevilla FC |
| CD Alcoyano | 0 – 1 | 2 – 2 | Valencia CF |
| UD Puertollano | 1 – 1 | 0 – 1 | Villarreal CF |
| Rayo Vallecano | 2 – 0 | 2 – 2 | Athletic de Bilbao |
| Hércules CF | 2 – 1 | 1 – 0 | UD Almería |
| UD Salamanca | 1 – 0 | 1 – 4 | Racing de Santander |
| Celta de Vigo | 2 – 1 | 1 – 0 | CD Tenerife |
| Recreativo de Huelva | 1 – 1 | 1 – 1 (4 – 2) | Sporting de Gijón |
| Real Murcia | 0 – 1 | 0 – 0 | Deportivo de La Coruña |
| Xerez CD | 1 – 2 | 0 – 1 | CA Osasuna |
| Real Valladolid | 2 – 1 | 0 – 1 | RCD Mallorca |
| Real Zaragoza | 1 – 1 | 0 – 0 | Málaga CF |
| Getafe CF | 2 – 0 | 1 – 1 | RCD Espanyol |